DNA聚合脢連鎖反應

 

  「聚合脢連鎖反應」(polymerase chain reaction, PCR)其實源於一個很簡單的想法,那就是如何利用DNA聚合脢複製DNA的速率及精確度,在試管中生產大量特定DNA片段。它的數學基本原理其實很單純,即由一變二、二變四,以2n倍數增加。

  體內控制DNA複製的條件相當複雜,所需的反應分子極多。DNA每複製一次後即由單股DNA歸回雙股DNA,此時相對應的鹽基便以A(腺嘌呤)對T(胸腺嘧啶)、G(鳥糞嘌呤)對C(胞嘧啶)以氫鍵結合而停止複製。若要把雙股DNA再變回單股,則需細胞核內的解股脢及單股DNA維持蛋白才能達成。在體外試管中,因無需顧慮高溫會使細胞致死,故可直接用高溫(90℃以上)來使雙股的DNA模板變為單股,但此時卻需顧慮所用的DNA聚合脢會因高溫變性而失效,然法重複使用。因為這個原因,試管複製DNA陷入兩難:不加熱,模板DNA無法變成單股;若加熱了,DNA聚合脢又會變性。

  因此,1985年穆理斯(Kary B. Mullis, 1944-)最先發表的PCR論文中所提供的方法是:於每一次複製把模板DNA加熱分開成單股後,就加一次DNA聚合脢,當時用的是由大腸菌(E. coli)中萃取純化的DNA聚合脢。但是若想把複製次數增加到二十至三十次時,上述方法變得繁瑣不堪,且因試管中變性的DNA聚合脢逐次增多,會妨礙DNA的產量。

  還好,中國人的發現改變了兩難困境。現任教於陽明大學神經科學研究所的錢嘉韻教授,早在1976年留美時即已報告了一項新發現:由美國黃石公園溫泉所分離出的某種細胞(Thermus aquaticus, YT-1),其DNA聚合脢具有耐高溫的特性。該篇論文詳述了此DNA聚合脢的純化步驟,以及此酵素的相關特性。例如,複製DNA的最適溫度(高達80℃)、最適pH值、二價鎂離子(Mg2+)的必要性,以及此酵素有別於E. coli的DNA聚合脢,並不具有外切核酸分解脢(3'à 5' exonuclease)之效等等。

  此篇論文後來被穆理斯所在Cetus公司工作的PCR發展小組所爰用。以Thermus aquaticus的DNA聚合脢(Taq DNA polymerase)取代了先前所用的E. Coli DNA聚合脢。這項改變使得PCR反應成為可以自動化的一項技術,只需在第一個複製循環時加一次Taq DNA聚合脢,即可連續複製三十個循環以上,所得DNA片段的特異性比用E. Coli的酵素要好得多。整個反應可使微量的DNA模板於二至三小時內,在一根試管中複製百萬倍以上。如此一來,PCR變得既省力(不需專人每二分鐘加一次酵素,要加三十次)、省時又省錢(酵素的用量是先前的1/30)。Cetus公司的研究小組於1988年重新整合PCR過程,發表了改用Taq DNA聚合脢後的PCR方法及其應用之潛力。

  整個過程簡單地來說只需在三種不同溫度下進行二十到三十個循環即可完成。

一、首先把模板DNA以94℃加熱30秒至一分鐘,使DNA由雙股分開成為單股。

二、把由人工合成的「引子對」(primer pair)加入反應試管中降溫到50℃左右,使引子對與單股模板DNA進行黏合(annealing),此步驟亦費時30秒至一分鐘。引子對是為決複製片段大小之關鍵所在。能在50℃與模板DNA完全吻合的引子對,必能把標定的基因片段正確地複製出來,降低因非特異性黏合所產生的非目標複製產物。這正是E. Coli DNA聚合脢在37℃所不能辦到的。

三、再升溫到72℃,讓Taq DNA聚合脢在其最適溫範圍複製前述有引子黏合的單股DNA模板,需時亦在一分鐘之內。所以完成前述一個循環只需二至三分鐘,在一個溫度循環機(thermal cycle)內完成三十次循環僅需時兩小時左右,即可把特定基因片段複製230倍。較之於一般的基因選殖方式,既省時又省力得多。

  自從1988年上述PCR流程發表後,應用此技術的論文數量亦急速上升,涵蓋範圍包括有遺傳疾病的診斷、病毒感染之診斷、產前嬰兒性別篩檢、法醫鑑定罪犯、考古學家鑑定古人身分及古生物種系的相關性等等,基礎醫學的研究更是林林總總,數不勝數。

  穆理斯回憶當初是在1983年,有一天晚上開車經過加州紅木森林區時,穫得了PCR的靈感。當他與同事分享的時候,大部分的人均對實驗的可行性抱持懷疑的態度,但是由於他的堅持,他成功了。這的確要歸功於他想到要利用耐高溫的Taq DNA聚合脢,才臻全功。Cetus公司認同他的想法,決定發展PCR之初曾因此獎勵他一萬美元,其後卻於1991年轉手把專利權以三億美元賣給了瑞士的羅氏藥廠(Hoffmann LaRoche),這家公司現正以連鎖反應般的速率賺進美鈔,由於此公司壟斷PCRTaq DNA聚合脢銷售市場,引發了科學研究人員之公開討論及反感。不論如何,穆理斯本身的成就卻沒有沾染太多的銅臭味,「讓學術歸學術,營利歸營利」。他到整個科學界的貢獻,絕非是金錢可評斷的。摘錄自 「諾貝爾的榮耀:化學桂冠」 科學月刊著 天下文化